کلمات کلیدی : کشت بافت، صبر زرد (Aloe barbadensis Mill) ، ریزازدیادی، کالوس، ترکیبات پلی‌فنلی

1-1 مقدمه:

بهبود کیفیت غذای مصرفی همیشه یکی از مهمترین دغدغه‌های بشری بوده است. ازاین‌رو اصلاح گیاهان به عنوان اصلی‌ترین منبع تولید موادغذایی، جهت افزایش کیفیت و کمیت مواد تولیدی همواره مورد‌ توجه انسان بوده‌است. در چند دهه گذشته، با گسترش اطلاعات بیوشمیایی و کشف مسیرهای بیوسنتزی انواع متابولیت‌های تولیدی در گیاهان، همچنین شناخت دقیق‌تر ساختارهای ژنتیکی و دستیابی به روش‌های دستورزی ژنتیکی، امکان خلق گیاهانی با توانایی‌های خارق العاده در تولید انواع متابولیت‌های ضروری در گیاهان فراهم شده است. در سال‌های اخیر گیاهانی که قدمت زیادی در رژیم غذایی و دارویی انسان دارند، به علت تاثیرات مطلوب متابولیت‌های تولیدی و نیز جایگاهی که این متابولیت‌ها از نظر فرآیندهای انتقال ژن دراستانداردهای ایمنی زیستی دارند، در کانون توجه بسیاری از محققان رشته‌های مختلف اعم از کشاورزی،‌ صنایع‌غذایی، دارویی و پزشکی قرارگرفته‌است (محمدی‌ و ذوالعلی، اسفند1388). در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با بهره گرفتن از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان، ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیرقابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با بهره گرفتن از بیوتکنولوژی درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته و پلی‌پلوئید را نام برد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم و تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایط این‌ویترو را فراهم می‌کند. مهمترین روش‌های تکثیر درون‌شیشه‌ای گیاهان، ریزازدیادی، اندام‌زایی ازطریق کالوس و جنین‌زایی سوماتیکی است. گزارش‌های متعددی در زمینه تکثیر گیاهان دارویی از طریق کالزایی وجود دارد. تولید کالوس قابلیت باززایی کالوس و ریشه‌زایی گیاهچه به عوامل متعددی بستگی دارد که مهمترین آن‌ها ژنوتیپ، ریزنمونه و شرایط فیزیولوژیک آنان، نوع محیط‌کشت و عناصرغذایی، عوامل فیزیکی و شرایط محیطی ازقبیل نور، دما، pH ، تنظیم‌کننده‌های‌رشد و ویتامین‌ها می‌باشد (باسو و چاند، 1996؛ ساتیش و بهاواناندان، 1988؛ شاسانی و همکاران1998).

1-2 اهمیت موضوع

کشت سلول، بافت و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر انبوه و سریع گیاهان و تولید متابولیت‌های ثانویه را در شرایط In Vitro فراهم می‌سازد. با بهره گرفتن از کشت In Vitro گیاه، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل‌شده و مستقل از محیط، افزایش تولید ترکیبات نسبت به گیاه و تولید ترکیبات جدید نیز امکان‌پذیر می‌گردد (بورگاد و همکاران، 2002).

گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشته‌اند. فناوری زیستی با بهره گرفتن از راهکارهایی نظیر کشت سلول، اندام‌ها و بافت‌ها، مهندسی ژنتیک و کاربرد نشانگرهای مولکولی قادر است کارایی و بهره‌وری گیاهان دارویی را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر سریع وانبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم را فراهم نموده است. گیاهان تکثیرشده از طریق کشت‌هایIn Vitro عاری از بیماری و از لحاظ ژنتیکی وکیفی یکنواخت می‌باشند (امیدی و فرزین، 1388).

کشت‌بافت گیاهی در زمینه گیاهان دارویی کاربردهای متعددی دارد که مهمترین آن‌ها عبارتند از: تکثیر انبوه و سریع گیاهان دارویی یکنواخت از لحاظ محتوای ژنتیکی وکیفی، حفظ گونه‌های گیاهی درحال انقراض از طریق نگهداری در شرایط انجماد و تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایطIn Vitro از طریق کشت سوسپانسیون سلولی و کشت اندام (مولاباگال وتسای، 2004؛ تریپاتی و تریپاتی، 2003).

روش‌های سنتی تکثیر گیاهان دارویی همانند سایر گیاهان شامل روش‌های جنسی (تکثیر با بذر) و غیرجنسی نظیر : قلمه، خوابانیدن، پاجوش و … می‌باشد. گیاهان تکثیر شده با بذر عمدتا از لحاظ ژنتیکی یکنواخت نیستند و گیاه حاصله دارای تمام خواص گیاه مادری نیست. به همین جهت تکثیر غیرجنسی به جنسی ترجیح داده می‌شود. روش‌های سنتی تکثیرغیرجنسی عمدتا با مشکلات متعددی از جمله محدودیت گیاه مادری و بازدهی پایین مواجه است. کشت‌بافت، نوعی تکثیر غیرجنسی است. مزیت تکثیر از طریق کشت‌بافت نسبت به سایر روش‌های مرسوم، تولید تعداد زیادی گیاه درمحیط in Vitro با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت، در زمان کوتاه‌تر و فضای نسبتا محدود می‌باشد (تریپاتی و تریپاتی، 2003).

فناوری زیستی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تولید سریع و انبوه ژنوتیپ‌های مطلوب با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت، در زمان کوتاه‌تر و فضای محدود فراهم می‌سازد. امروزه تعداد زیادی از گیاهان دارویی از طریق ریزازدیادی قابل تکثیر می‌باشند (امیدی و فرزین، 1391).

تشکیل کالوس مرحله‌ای اساسی در کشت درون‌شیشه‌ای بسیاری از سلول‌ها و بافت‌های گیاهی و نیز برخی از روش‌های مهندسی ژنتیک است. برای مثال، کالوس‌های کشت‌شده در شرایط درون‌شیشه‌ای تکثیر شده و تعداد زیادی سلول ایجاد می‌کنند که از طریق اندام‌زایی یا جنین‌زایی رویشی قابلیت باززایی و تبدیل شدن به گیاه کامل را دارند. علاوه بر این، بافت کالوس عمدتا به عنوان بافت هدف برای دستکاری ژنتیکی استفاده می‌شود و تشکیل کالوس برای باززایی بافت‌های تراریخت لازم است. از کالوس‌های سست و نرم عموما برای ایجاد کشت سوسپانسون سلولی نیز استفاده می‌شود (اثنی‌عشری، 1388).

این گیاه در ایران با نام صبرزرد و یا شاخ بزی نیز معروف است. تنها گونه بومی موجود در ایران آلوئه ورا می‌باشد که در نواحی جنوب ایران و گونه آلوئه لیتورالیس در ارتفاعات بشاگرد می‌روید. از میان گونه‌های شناخته شده آلوئه، تنها 4 گونه آن برای انسان و دام خوراکی هستند که گونه آلوئه‌ورا در صدر آن قرار دارد (میرزایی ندوشن و همکاران، 1383 و آگاروال، 2008).

بکارگیری روش‌های نوین زیستی در تولید، تکثیر و دست‌ورزی ژنتیکی این گیاه می‌تواند نقطه عطفی را در صنایع غذایی و دارویی ایجاد نماید. این گیاه به دلیل توانایی بالا در تحمل شرایط سخت خشکی و کم‌آبی، در سرتاسر دنیا گسترش یافته است. بهینه‌سازی فرآیند کشت‌بافت و باززایی آلوئه با تثبیت و واسطه‌گری کشت کالوس، راه‌گشای انجام تحقیقات بنیادی و کاربردی در زمینه‌های مختلفی نظیر القای جنین‌های سوماتیکی و تولید بذرمصنوعی، تثبیت کشت‌های سوسپانسیون سلولی و اصلاح گیاه از طریق تنوع سوماکلونال خواهد بود (محمدی و ذوالعلی، 1388).

به طور کلی در آلوئه‌ها، افزایش رویشی از راه جداسازی پاجوش‌ها و با تقسیم بوته متداول است ولی تکثیر این گیاه از راه جداسازی پاجوش‌ها کند بوده و وقت‌گیر است. بنابراین گیاهان محدودی از یک گیاه مادری به دست می آید. این موضوع عامل بازدارنده‌ای برای گسترش تولیدات صنعتی محسوب می‌گردد. با توجه به اهمیت گیاه صبرزرد و نبود مواد گیاهی کافی، کشت و کار این گیاه در سطح زیاد ایجاد محدودیت می‌کند که با روش ریزافزایی می‌توان بر این مشکل چیره شد (کواست، 1979؛ ناتالی و همکاران، 1990).

با توجه به این‌که پلی‌فنل‌ها، موادی هستند که در اولین مراحل بیوسنتزی تولید آنتی‌اکسیدان‌های مهمی نظیر فلاونوئید‌ها و آنتوسیانین‌ها را می‌کنند، لذا افزایش تولید این ترکیبات به کمک استفاده از غلظت‌های بهینه هورمون‌های اکسین و سیتوکینین می‌تواند روشی برای افزایش فلاونوئید‌ها و آنتوسیانین‌ها باشد. این دو ماده از مهمترین مواد آنتی‌اکسیدانی می‌باشد که در جلوگیری از بروز سرطان نقش بسیار مهمی دارد. در گیاه آلوئه‌ورا دو متابولیت ثانویه آلودین و امودین از همین مسیر بیوسنتزی استفاده می‌کند. درنتیجه با افزایش تولید ترکیبات پلی‌فنلی می‌توانیم میزان این متابولیت‌های ثانویه ونیز آنتی‌اکسیدان‌ها را افزایش دهیم (احمد و همکاران، 2007).

از آنجایی که تکثیر این گیاه از روش‌های مرتبط با بذر، به واسطه وجود نرعقیمی گسترده، راندمان پائینی دارد، تنها راه کشت سنتی آلوئه، تکثیر از طریق پاجوش است. با توجه به اینکه در طول یکسال حداکثر تا 4 پاجوش را می‌توان از یک گیاه 2 ساله جداسازی نمود، این موضوع رشد صنایع غذایی و دارویی مرتبط با این گیاه سودمند را به شدت کند خواهد کرد. لذا کاربرد تکنیک‌های مختلف کشت‌بافت در مورد این گیاه بسیار سودمند خواهد بود. با این حال اکثر تحقیقات انجام شده در راستای ریز‌ازدیادی این گیاه، با روش شاخسارزایی مستقیم